Энзимология
|
Скачать 0.9 Mb.
|
|
2. После этого разводим лимфоциты до нужной концентрации. В связи с тем, что моноциты адсорбируются на поверхности стеклянной пробирки, то данным методом выделяются именно лимфоциты. Например, если количество подсчитанных клеток в 5-ти больших квадратах равно 100 и нужна концентрация 1 млн/мл, то считаем следующим образом: 1   00 клеток - 0,02*10-3 млХ клеток - 1 мл Следовательно 5 млн лимфоцитов содержится в 1 мл исследуемой смеси. Таким образом, для приготовления смеси с заданной концентрацией (в данном примере 1 млн/мл), необходимо произвести разведение в 5 раз, то есть взять одну часть смеси с концентрацией 5000000 и 4 части среды для разведения. 5.4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА Для количественного определения белков используют физические, химические и биологические методы. Из физических методов простейшим является взвешивание чистого белка. Однако белки очень гигроскопичны, и полностью удалить из их состава воду очень трудно, поэтому этот способ применяют редко. Наибольшее распространение из физических методов количественного определения белков получили три – рефрактометрический (по показателю преломления белковых растворов), спектрофотометрический (по поглощению в ультрафиолетовой области спектра) и полярографический (по кривым, показывающим зависимость между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок), пикнографический метод (по плотности белковых растворов). Химические методы количественного определения белков разнообразны. Наиболее простой химический метод определения – количественное определение общего или белкового (после осаждения белка и отделения его от растворимых азотсодержащих веществ) азота. Самым распространенным методом количественного определения белков является колориметрический метод. Он основан на измерении интенсивности цветных реакций, развивающихся при взаимодействии белков с тем или иным специфическим реагентом. Чтобы рассчитать концентрацию белка, строят калибровочный график. Биологические методы количественного определения белков применимы лишь к белкам, обладающим ферментативной и гормональной активностью. Измеряя степень биологической активности препарата, можно составить представление о содержании в нем белка, обладающего данной активностью. Этот метод не дает абсолютных результатов. Биуретовый метод Принцип метода: биуретовый метод основан на способности растворов белка давать фиолетовое окрашивание при взаимодействии с раствором сульфата меди в щелочной среде. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации белка в растворе. Исследуемый раствор: стандартный раствор белка, содержащий 10 мг в 1 мл. Реактивы: биуретовый реактив – 0,15 г CuSO4 5H2O и 0,6 г NaKC4H4O6·4H2O (виннокислый натрий-калий, или сегнетова соль) растворяют в 50 мл Н2О, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10%-ного раствора NaOH (свободного от Na2CO3), добавляют 0,1 г КI и доводят водой до 100 мл. Хранят в полиэтиленовой склянке. Оборудование: пробирки, пипетки, ФЭК, кюветы с длиной светового пути 5 мм. Ход работы: в 4 сухие пробирки вносят по 0,5 мл раствора белка. В три пробирки помещают стандартные растворы с содержанием белка 2,5; 5,0; 7,5 мг в 1 мл. Эти пробирки служат для построения калибровочной кривой. В 4-ю пробирку наливают раствор с неизвестной концентрацией белка, которую необходимо определить. В каждую пробирку добавляют по 2 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин для развития окраски. Окрашенные растворы колориметрируют на ФЭКе в кюветах с длиной оптического пути 5 мм, пользуясь зеленым светофильтром (длина волны 540 нм). В качестве контрольного раствора при измерении на ФЭКе используют биуретовый реактив. Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрации стандартных растворов белка, а на оси ординат – соответствующие значения оптической плотности. Зная оптическую плотность раствора белка с неизвестной концентрацией, по калибровочной кривой определяют в нем содержание белка. Микробиуретовый метод Принцип метода: биуретовый метод основан на способности растворов белка давать фиолетовое окрашивание при взаимодействии с раствором сульфата меди в щелочной среде. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации белка в растворе. Исследуемый материал: стандартный раствор белка, содержащий 1 мг в 1 мл. Реактивы: биуретовый реактив для микроопределения (реактив Бенедикта) – 17,3 г цитрата натрия и 10 г Na2CO3 растворяют при подогревании в небольшом количестве воды, в раствор добавляют 1,73 г сульфата меди, растворенного в 10 мл воды, и доводят водой до 100 мл; 6%-ный раствор NaOH. Оборудование: пробирки, пипетки, спектрофотометр, кюветы Ход работы: к 2 мл раствора, содержащего 0,1-2,0 мг белка, добавляют 2 мл 6%-ного раствора NaOH и 0,2 мл раствора Бенедикта. Раствор хорошо перемешивают и через 15 мин фотометрируют при 530 нм на спектрофотометре. Предварительно строят график по стандартному раствору белка. Метод Брэдфорда Принцип метода: метод основан на связывании с белками одного из кислых красителей кумасси синего. При связывании с белками спектр поглощения красителя меняется. Интенсивности окраски от концентрации белка в пробе в диапазоне 1-10 мкг/мл имеет линейную зависимость. Поскольку белки различаются по своей способности связывать красители, желательно строить калибровочный график с использованием того белка, концентрацию которого в дальнейшем предполагают определить. Исследуемый материал: стандартный раствор белка, содержащий 0,05 мг/мл. Реактивы: раствор красителя – 10 мг кумасси G-250 гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе в 5 мл 95%-ного спирта, полученный раствор смешивают с 10 мл 95%-ной фосфорной кислоты, разводят до конечного объема 100 мл. Отфильтрованный раствор красителя хранится около 2 недель. Оборудование: пробирки, пипетки, спектрофотометр, кюветы. Ход работы: 1,5 мл раствора, содержащего от 10 до 50 мкг белка, смешивают с 1,5 мл раствора красителя. Через 3-5 мин измеряют оптическую плотность при 595 нм, используя в качестве контроля пробу, не содержащую белка. В описанной модификации А595 линейно зависит от количества белка в интервале от 10 до 50 мкг. Спектрофотометричекий метод Метод основан на способности ароматических аминокислот (триптофана, тирозина, фенилаланина) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом при 280 нм. Измеряя величину оптической плотности при этой длине волны, находят количество белка в растворе. Поскольку белки отличаются по содержанию ароматических аминокислот, их поглощение в ультрафиолетовой области спектра может сильно различаться. Условно считают, что при концентрации «усредненного» белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1,0 (при толщине кюветы 1,0 см). Определению белка данным методом мешает присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов, поэтому измеряют оптическую плотность раствора при 260 нм (для учета поглощения соединений нуклеотидной природы) и 280 нм. Исследуемый материал: стандартный раствор белка, содержащий 1-5 мг/мл. Оборудование: пробирки, пипетки, спектрофотометр, кюветы Ход работы: содержание белка находят по формуле Калькара на основе данных определения оптической плотности при 280 и 260 нм: Содержание белка (мг/мл) = 1,45 * А280 – 0,74 * А260 Библиографический список
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Способы количественного выражения активности ферментов и содержания внутриклеточных метаболитов Общепринято активность ферментов и содержание внутриклеточных метаболитов выражать на мл упакованных клеток, на грамм (мг) белка, на грамм (мг) гемоглобина (в случае использования эритроцитов) или на число клеток. В связи с этим, в расчётных формулах, необходимо вводить такие параметры, как величина гематокрита (см. раздел 5), содержание белка (гемоглобина) (см. раздел 6), количество клеток (см. раздел 5). Е на мл эритроцитов =  :Е на 1011 эритроцитов =  ;Е на гр.Нb =  ;где  – изменение абсорции за 1 минуту;V-общий объём инкубационной пробы в мл; f – фактор разведения гемолизата; ε – коэффициент экстинции; l – длина оптического пути кюветы, в см.; V – объём добавленного гемолизата, в мл. 2. Расчёт центрифужного поля Центрифужное поле (g) можно вычислить по формулам (1) (2): (1) g = 1118 * 10-8 * R * N2, где R (см) – радиус от центра ротора центрифуги до точки, в которой необходимо вычислить центрифужное поле; N (об/мин) – скорость вращения ротора. (2) g = 284 * 10-7 * R * N2, где R (дюймы) – радиус от центра ротора центрифуги до точки, в которой необходимо вычислить центрифужное поле; N (об/мин) – скорость вращения ротора. Пересчёт об/мин в g для центрифуги ОПН-3: 1500 об/мин = 430 g 3000 об/мин = 1700 g Пересчёт об/мин в g для центрифуги ОПН-8: 8000 об/мин = 6000 g 3. Приготовление инкубационной среды При исследовании метаболизма клеток крови необходима долговременная их инкубация, которая требует использования инкубационных сред различного состава. В качестве таких сред наиболее часто используют раствор Кребс-Рингера, среду Хенкса и среду 199.
Раствор Кребс-Рингера готовят смешиванием следующих растворов: 1). 2 мл 0,6 М NaCl, 2). 1 мл 56 мМ KCl, 3). 1 мл 20 мМ MgCl2, 3). 1 мл 20 мМСаСl2, 4). 1 мл 10 мМ Na2HPO4, 5). 4 мл 60 мМ трисHCl-буфера, рН 7,4, Глюкоза добавляется в среду в виде порошка и непосредственно перед началом инкубации. Конечная концентрация глюкозы должна составлять 10 мМ. В случае инкубации упакованных эритроцитов соотношение среды Кребс-Рингера и клеток составляет (2:1). Среда Хенкса и среда 199 обычно используются уже готовые. 4. Приготовление раствора Олсвера Олсвера раствор – раствор, предназначенный для сохранения эритроцитов. Состав: 24,6 г глюкозы, 9,6 г натрия цитрата, 5,04 г натрия хлорида, 1200 мл дистил. воды. Стерилизуют фильтрованием. Для консервации эритроцитов барана 1 ч. крови смешивают с 1 ч. О.р.; эритроцитов человека, морской свинки, кур - 5 ч. крови с 1 ч. О.р. Эритроциты пригодны в течение 8-12 дней. С этой целью также применяют азид натрия, боратный буфер с сорбитом, гипертонический р-р натрия хлорида, рН 6,0 - 6,4 (Ричардсона м-д). ОГЛАВЛЕНИЕ
Учебное издание Подготовлено к изданию РИО БИК СФУ Подписано в печать 2012 г. Формат 60х84/16 Бумага офсетная. Печать плоская Усл. печ. л. Уч.-изд. л. Тираж экз. Заказ (дает РИО) Редакционно-издательский отдел Библиотечно-издательского комплекса Сибирского федерального университета 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 79 Тел/факс (391) 206-21-49. E-mail [email protected] http://rio.sfu-kras.ru Отпечатано Полиграфическим центром Библиотечно-издательского комплекса Сибирского федерального университета 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 82а Тел. 206-26-58, 206-26-49 |